Zagrał on w ponad 50 filmach kinowych i telewizyjnych, między innymi "Rękopis znaleziony w Saragossie", "Pętla", "Sanatorium pod Klepsydrą", "Lawa", "Marysia i Napoleon", w serialu "Królewskie sny", ekranizacji "Mistrza i Małgorzaty". Wystąpił w ponad 130 przedstawieniach Teatru Telewizji, współpracując między innymi z Adamem Hanuszkiewiczem, Zygmuntem Huebnerem, Andrzejem Łapickim, Andrzejem Wajdą i Krzysztofem Kieślowskim.
Przez wiele lat aktor grał w Teatrze Polskiego Radia, w którym wcielił się w różne postaci w ponad 200 słuchowiskach i adaptacjach literackich, a który to teatr darzył szczególnym sentymentem. Gustaw Holoubek podkreślał, że Radiowy Teatr Wyobraźni stawia przed aktorem wysokie wymagania.
W okresie stanu wojennego Gustaw Holoubek grał w spektaklach przygotowywanych w Muzeum Archidiecezji Warszawskiej, które stało się głównym ośrodkiem sztuki niezależnej. Do historii przeszło sejmowe przemówienie posła Holoubka w stanie wojennym, wygłoszone w obronie "Solidarności". Po 1989 roku został senatorem I kadencji.
Za pracę aktorską i reżyserską Gustaw Holoubek był wielokrotnie honorowany, między innymi otrzymał Wielką Nagrodę Fundacji Kultury oraz Złoty Medal "Zasłużony Kulturze Gloria Artis". Gdy w 1991 roku odebrał Nagrodę Polskiego Radia - Wielki Splendor - powiedział, że radio i jego teatr zawsze było miejscem autentycznej wypowiedzi artystycznej.
Gustaw Holoubek przez wiele lat był dyrektorem Teatru Dramatycznego w Warszawie, w którym w grudniu 1981 roku odbywał się Kongres Kultury Polskiej, przerwany przez stan wojenny. W 1983 roku Holoubek został odwołany ze stanowiska z powodu konfliktu z ówczesnymi władzami. Od 1989 roku był wykładowcą warszawskiej PWST, obecnie Akademii Teatralnej.
Zmarł 6 marca 2008 roku, w wieku 84 lat. Został pochowany na warszawskich Powązkach. Prezydent Lech Kaczyński uhonorował go pośmiertnie najwyższym polskim odznaczeniem - Orderem Orła Białego.
W książce wydanej w 2004 roku i zatytułowanej "Powołać do życia iluzję" Gustaw Holoubek pisał: "Jedna wszakże okoliczność pomimo różnic światopoglądowych czyni nas podobnymi. Nie wiem nawet, czy nie jest jedynym, wspólnym dla wszystkich, znakiem człowieczeństwa. To jest tęsknota za światem wyobrażonym. Światem idealnym, w którym wszystkie normy estetyczne i wszystkie normy moralne znalazłyby urzeczywistnienie. W którym uwolnieni od wszelkich ułomności moglibyśmy realizować siebie. Czy teatr nie jest wynalazkiem materializującym to pragnienie?".
IAR/PP