Pochodziła z arystokratycznego rodu i podobnie jak jej liczne rodzeństwo posiadała uzdolnienia artystyczne. Ojciec Amilcare Anguissola wspierał ją w rozwoju talentu malarskiego. Był promotorem jej sztuki, m.in. pomagał jej zdobywać prestiżowe i intratne zamówienia na portrety członków rodów królewskich i arystokracji.
Dokonania Anguissoli zyskały uznanie malarza i rzeźbiarza renesansowego Michała Anioła. Jako uznana malarka została zaproszona na królewski dwór hiszpański przez króla Filipa II. Po śmierci swej protektorki i uczennicy - królowej Elżbiety de Valois, opuściła Madryt. Była dwukrotnie zamężna, najpierw z Sycylijczykiem, a potem z Genueńczykiem. W późnych latach swego życia (a dożyła ponad 92 lat) straciła wzrok, jednak jej prestiż jako wybitnej malarki skłonił młodego Antona van Dycka do udania się do niej po rady.
Sofonisba Anguissola jest uważana za jedną z najwybitniejszych portrecistek, wymienia się jej nazwisko razem z nazwiskami Tycjana i Antona van Dycka. Jej spuścizna artystyczna składa się z ponad 50 obrazów. Jej obrazy znajdują się m.in. w Uffizi we Florencji, w Prado w Madrycie, w Turynie, Neapolu, Berlinie i Budapeszcie, a także w Muzeum Narodowym w Poznaniu.
